Der MT2-Rezeptor ist ein Haupttyp des G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der hauptsächlich die Wirkung von Melatonin vermittelt. Defizite der Melatonin/ MT2-Signalgebung wurden bei vielen neurologischen Erkrankungen gefunden, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, der häufigsten Ursache für Demenz bei älteren Menschen, was darauf hindeutet, dass die Erhaltung des MT2-Rezeptors für diese neurologischen Störungen von Vorteil sein kann. Der direkte Nachweis, der den MT2-Rezeptor mit der kognitionsbedingten synaptischen Plastizität verbindet, muss jedoch noch nachgewiesen werden. Hier berichten wir, dass der MT2-Rezeptor, aber nicht der MT1-Rezeptor, für die Axonogenese sowohl für die Axonogenese essentiell ist.in vitroundim lebenden Organismus. Wir finden heraus, dass die Axonbildung in MT2-Rezeptor-Knockout-Mäusen, MT2-shRNA-elektroporierten Hirnschnitten oder primären Neuronen, die mit einem MT2-Rezeptor-selektiven Antagonisten behandelt werden, verzögert ist. Die Aktivierung des MT2-Rezeptors fördert die Axonogenese, die mit einer Verstärkung der exzitatorischen synaptischen Übertragung in zentralen Neuronen einhergeht. Die dem MT2-Rezeptor nachgeschalteten Signalkomponenten bestehen aus dem Akt/GSK-3β/CRMP-2 Kaskade. Das C-terminale Motiv des MT2-Rezeptors bindet direkt an Akt. Entweder die Hemmung des MT2-Rezeptors oder die Störung der MT2-Rezeptor-Akt-Bindung reduziert die Axonogenese und die synaptische Übertragung. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der MT2-Rezeptor Akt/GSK-3 aktiviertβ/CRMP-2-Signalisierung und ist notwendig und ausreichend, um funktionelle Axonogenese und synaptische Bildung in zentralen Neuronen zu vermitteln.
Synaptische Schaltkreise werden an den Stellen des axon-dendritischen, axon-somatischen oder Axon-axonalen Kontakts aufgebaut, bei denen die funktionelle Axonogenese ein kritischer Schritt ist. Die Axonogenese kann durch viele intrazelluläre Signale reguliert werden, die Zytoskelettumlagerungen, lokalen Proteinabbau sowie Diffusionsbarrieren beinhalten. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mehrere extrazelluläre neurotrophe Faktoren und Hormone eine Rolle bei der Axonführung und synaptischen Bildung in zentralen Neuronen spielen. Bis heute ist die Rolle von Melatonin und seinen Rezeptoren bei der Axonogenese unklar. Die meisten biologischen Funktionen von Melatonin werden durch seine beiden Rezeptoren, MT1- und MT2-Rezeptoren, vermittelt, die beide zur Unterfamilie des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) gehören und im gesamten Zentralnervensystem (ZNS) weit verbreitet sind. Die Aktivierung des MT2-Rezeptors als Reaktion auf Melatonin ist entscheidend für die Kontrolle des circadianen Rhythmus und die Regulation des langsamwelligen Schlafes. Frühe Studien haben gezeigt, dass die Aktivierung des MT2-Rezeptors in der Netzhaut die Freisetzung von Dopamin reduziert, während Dopamin die Wachstumskegelmotilität und das Neuritenwachstum während der Embryonalentwicklung hemmt, was auf die Beteiligung des MT2-Rezeptors an der funktionellen Axonogenese hindeutet. Bei mutierten Mäusen mit mangelhafter Expression des MT2-Gens ist die Induktion der Langzeitpotenzierung (LTP) der exzitatorischen synaptischen Übertragung beeinträchtigt, und diese Beeinträchtigung steht in engem Zusammenhang mit Lerndefiziten. Im Hippocampus hemmt der MT2-Rezeptor den GABAA-Rezeptor-vermittelten Strom, der an der synaptischen Übertragung beteiligt ist. Bei der Alzheimer-Krankheit ist die Expression des MT2-Rezeptors signifikant reduziert, insbesondere im Hippocampus. Ein partieller Agonist des MT2-Rezeptors, UCM765, zeigt anxiolytische Eigenschaften, indem er die Im offenen Arm eines erhöhten Plus-Labyrinth-Tests verbrachte Zeit erhöht und die Latenz zum Essen in einer neuartigen Umgebung im neuheitsunterdrückten Fütterungstest reduziert, was auf seine Rolle bei angstzuständen hindeutet. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der MT2-Rezeptor die Signalkaskaden verbindet, die Lernen und Gedächtnisbildung vermitteln, eine der wichtigen biologischen Funktionen von Melatonin; Die zellulären und molekularen Ereignisse, die dieser Verknüpfung zugrunde liegen, müssen jedoch noch festgestellt werden.
Dissoziierte Hippocampus-Neuronen wurden häufig als ausgezeichnetein vitroModell in der Untersuchung der Axonentwicklung und synaptischen Übertragung, da sie morphologische, funktionelle und molekulare Eigenschaften der Hippocampus-Neuronen aufrechterhaltenim lebenden Organismus.In dissoziierten Hippocampus-Neuronen umfasst der Übergang zur Axonbildung und -reifung die folgenden fünf Stadien: Neuronen des Stadiums 1 (~ 2 bis 4 h nach der Beschichtung) zeigen reichlich Lamellipodien und Filopodien, die sich im Stadium 2 (~ 12 bis 24 h) zu mehreren unreifen kurzen Neuriten entwickeln; Die Polarisation tritt im Stadium 3 (~ 24 bis 48 h) auf, in dem ein einzelner Neurit eine schnelle Dehnung einleitet, um zum Axon zu werden, während andere eine dendritische Identität erwerben; Stadium 4 (~3–4 Tage) ist durch schnelles Auswachsen von Axon und Dendriten gekennzeichnet; und im Stadium 5 (ab 7 Tagen) ist die Reifung von Axon und Dendriten für die funktionelle Synapsenbildung unerlässlich. In der vorliegenden Studie haben wir eine neue Rolle für den MT2-Rezeptor in der funktionellen Axonogenese identifiziert und gezeigt, dass die Aktivierung des MT2-Rezeptors entscheidend für die funktionelle Axonogenese und die synaptische Übertragung in zentralen Neuronen ist. Mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer -Bildgebung (FRET) in Kombination mit Peptidblockierungsassays haben wir Akt als interagierenden Partner und Substrat des MT2-Rezeptors identifiziert. Die Aktivierung der MT2-Rezeptor-Akt-Signalkaskade fördert die Bildung funktioneller Synapsen im Hippocampus, während die Hemmung des MT2-Rezeptors die Axonogenese und synaptische Übertragung aufhält. Angesichts der Implikationen des MT2-Rezeptors für Lernen und Gedächtnis schlagen wir vor, dass die gezielte MT2-Rezeptor-Akt-Signalisierung eine praktikable Strategie zur Stimulierung der funktionellen synaptischen Schaltkreise sein könnte.
Akkumulation des MT2-Rezeptors in polarisierten Axonen
Um die Rolle von MT1- und MT2-Rezeptoren bei der Axonentwicklung zu untersuchen, haben wir zunächst ihre zelluläre Lokalisation in dissoziierten Hippocampus-Neuronen von Ratten durch Co-Immunfärbung für den MT1-Rezeptor oder MT2-Rezeptor und Tuj1, eine neuronenspezifische Klasse III, gemessen.β-Tubulin. Wir fanden heraus, dass der MT2-Rezeptor gleichmäßig auf allen Neuriten mit Spitzenanreicherung in Neuronen des Stadiums 2 verteilt war, während ein starkes Fluoreszenzsignal nur an der polarisierten Axonspitze, nicht aber in den Dendriten in Neuronen des Stadiums 3 nachgewiesen wurde. Quantitative Analysen zeigten, dass der MT2-Rezeptor an den Neuritspitzen in Neuronen des Stadiums 2 differentiell angereichert war, während eine exklusivere Axonspitzenanreicherung des MT2-Rezeptors in Neuronen des Stadiums 3 beobachtet wurde. Der MT1-Rezeptor hatte eine ähnliche Verteilung wie der MT2-Rezeptor im Stadium 2, aber im Stadium 3 wurde keine polarisierte Verteilung des MT1-Rezeptors nachgewiesen. Die Spezifität des MT2-Rezeptor-Antikörpers wurde durch das Peptidblockierungsexperiment nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der MT2-Rezeptor eine potenzielle Rolle bei der Axondifferenzierung spielen könnte, einem frühen Stadium der Synapsenentwicklung.